Version courte:
Les protéines de chaque échantillon ont été dissoutes dans de l'urée 8 M, puis réduites et alkylées. Les échantillons ont été digérés avec de la trypsine. Les peptides résultants ont été analysés par chromatographie en phase liquide/ionisation par électronébuliseur haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-ESI-MS/MS). Les spectres MS/MS acquis ont été recherchés dans la base de données de séquences de protéines de l'IPI (International Protein Index) (version 3.85) en utilisant Maxquant avec l'option LFQ (quantification exempte d’étiquette). Le FDR (taux de fausses découvertes) a été fixé à ≤ 1 % sur le niveau des protéines et des peptides. La quantification a été effectuée en utilisant une intensité LFQ normalisée.
Version longue:
L'urée 8M dans 50 mM ABC a été utilisée pour reconstituer les protéines. La réduction et l'alkylation ont été effectuées en ajoutant du DTT à une concentration finale de 20 mM à 56 °C pendant 30 minutes, suivie de 40 mM IAA à température ambiante. La solution a ensuite été diluée 5 fois en ajoutant 50 mM ABC. La trypsine a été ajoutée pour obtenir un rapport protéine-enzyme de 50:1. La digestion a été effectuée à 37 °C pendant la nuit, avec un brassage continu. Les peptides digérés ont ensuite été dessalés sur la colonne Sep-Pak (Waters) et séchés dans SpeedVac (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA). Les peptides séchés ont été reconstitués dans 0,5 % (v/v) de FA.
Toutes les analyses de MS ont été effectuées par HPLC-ESI-MS/MS. Le système était composé d'un système Agilent 1100 micro-HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, É.-U.) couplé à un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA) équipé d'une interface nano-électronébulisation fonctionnant en mode ion positif. Les phases mobiles se composaient de 0,1 % (v/v) de FA dans l'eau comme tampon A, et de 0,1 % (v/v) de FA dans l'acétonitrile comme tampon B. La séparation des peptides a été effectuée sur une colonne analytique de 75 μm × 100 mm emballée en interne avec résines Magic C18AQ en phase inverse (1,9 μm, taille de pores de 120 Å, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Allemagne). Brièvement, l'échantillon a été chargé sur la colonne en utilisant 98 % du tampon A à un débit de 1,5 μl/min pendant 15 minutes. Ensuite, un gradient de 5 % à 35 % du tampon B (20~50 % pour le test d'appauvrissement d'APols) a été effectué en 120 min à un débit de ~300 nL/min obtenu en divisant 20 μL/min à travers un restricteur. La méthode MS comprenait une analyse MS complète de 300 à 1700 m/z, suivie d'une analyse MS/MS dépendant des données sur les 5 ions les plus intenses, avec un nombre de répétitions d'exclusion dynamique de 2 et une durée répétée de 90 s. De plus, pour les expériences sur l'Orbitrap MS, la MS complète était réalisée dans l'analyseur Orbitrap avec R = 60 000 définis à m/z 400, alors que l'analyse MS/MS a été effectuée dans le LTQ. Pour améliorer la précision de la masse, toutes les mesures dans l'analyseur de masse Orbitrap ont été effectuées avec un recalibrage interne (« masse de référence »). Sur l'Orbitrap, la fonction de rejet d'état de charge a été activée, avec des états de charge simples et non attribués rejetés.
Les fichiers bruts générés par LTQ-Orbitrap ont été traités et analysés en utilisant MaxQuant, version 1.2.2.5 et en utilisant la base de données Uniprot sur les protéines (version de juillet 2012), incluant les contaminants fréquemment observés. Les paramètres suivants ont été utilisés : la carbamidométhylation de cystéine a été choisie comme modification fixe, et l'oxydation de la méthionine, l'acétylation de la protéine N-terminale et la spécificité enzymatique ont été fixées à la trypsine. Jusqu'à deux clivages manquants de trypsine ont été autorisés. Les tolérances de masse d'ions précurseurs étaient de 7 ppm et la tolérance de masse d'ions fragments était de 0,8 Da pour les spectres MS/MS. Lorsque les séquences peptidiques identifiées d'une protéine étaient égales ou contenues dans l'ensemble de peptides d'une autre protéine, les protéines ont été regroupées et déclarées comme un groupe protéique. Le FDR (taux de fausses découvertes) pour le peptide et la protéine a été fixé à 1 %, et une longueur minimale de six acides aminés a été utilisée pour l'identification des peptides. La quantification a été effectuée en utilisant une intensité LFQ normalisée.
