Chromatographie en phase gazeuse Spectrométrie de masse GC-MS.
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Installation de spectrométrie de masse John Holmes Création et analyse d'hydrosols 124 Salle D'iorio Université d'Ottawa
Aperçu
Ce document vous instruira sur les principes de base de GC:MS et les procédures de fonctionnement.
Buts
Pour comprendre comment fonctionne le GC:MS, vous pouvez donc créer une méthode pour l'exécuter.
Pour analyser un échantillon et obtenir une bonne séparation des composants chimiques sur la colonne.
Utiliser le logiciel d'analyse de données pour identifier les composants chimiques et évaluer la précision et l'exactitude.
Caractéristiques
1. Les instruments disponibles sont des Agilent GC-MS il y en a 3. Comme indiqué dans le nom, il y a deux parties à l'instrument. La section de chromatographie en phase gazeuse, nous avons des modèles HP 6890, 7820A et 6890N Agilent, Hewlett Packard a été acheté par Agilent. Les spectromètres de masse sont tous des sources d'impact d'électrons (EI) avec un seul filtre de masse quadripolaire (Quad). Modèles : 5975 MSD et 5975C. Instruments GC-MS, Systèmes GC-MS, Analyse GC-MS | Agilent Bref résumé de la procédure Une méthode est créée dans le logiciel GC et téléchargée sur l'instrument. Une solution diluée de 1 ul d'hydrolat entièrement soluble créée comme indiqué précédemment et raffinée à l'aide d'une cartouche d'extraction en phase solide est injectée dans l'entrée de la section GC de l'instrument. Le procédé est démarré et la rampe du four GC chauffe la colonne qui contient les composants de l'hydrosol qui ont été vaporisés à l'entrée et transportés vers la colonne par le gaz porteur d'hélium. Au fur et à mesure que le four devient plus chaud, les composants chimiques individuels s'éluent de la colonne GC en fonction de leurs points d'ébullition et de leurs interactions avec la colonne. Les molécules entrent dans la source d'ions du spectromètre de masse où elles sont ionisées et se fragmentent. L'ion moléculaire (M+) et les fragments sont ensuite séparés par le spectromètre de masse quadripolaire et arrivent au détecteur où leur masse à charger est représentée graphiquement en fonction de leur intensité, c'est ce qu'on appelle le spectre de masse. Chaque molécule aura un spectre de masse différent, ainsi ce graphique devient l'empreinte digitale individuelle de cette molécule et peut être comparé à un spectre de masse standard du composé pur qui est contenu dans une base de données dans le logiciel de l'instrument, les données de milliers de molécules sont contenus dans la base de données. Les spectres de masse d'impact électronique sont également contenus dans le Nist Chemistry Webbook, NIST Chemistry WebBook. Jalons Créer une méthode dans le GC Un certain nombre de paramètres peuvent être contrôlés dans la section de chromatographie en phase gazeuse. Ceux-ci inclus: Débit du gaz porteur d'hélium. La température d'entrée doit être suffisamment élevée pour vaporiser toutes vos molécules, mais pas trop élevée pour les décomposer. La rampe de température sur la colonne GC doit commencer à la première apparition d'un composé, ne doit pas commencer pendant l'élution du solvant et doit se terminer juste après le dernier composé et être suffisamment lente pour séparer tous vos composants et pas trop lente pour durer heures.
Créer une méthode dans le MS La méthode MS peut être modifiée pour vous permettre de sélectionner uniquement des ions particuliers et de surveiller uniquement ceux-ci, c'est ce qu'on appelle un balayage de surveillance d'ions uniques, ceci est utilisé pour des méthodes très spécifiques, généralement la spécification de masse est réglée pour balayer de 18 à 614 da. Parfois on commencera la messe à 33da pour ne pas enregistrer d'air. Nous avons également désactivé le spectromètre de masse pendant les 3 à 4 premières minutes si le solvant apparaît à ce moment-là. Le solvant est 999 fois plus concentré que notre échantillon et il a un point d'ébullition bas, il traversera donc tout l'appareil dans les premières minutes. Nous ne voulons ni n'avons besoin de l'enregistrer. Une fois notre méthode créée, nous pouvons la nommer et l'enregistrer sur l'ordinateur et nous assurer qu'elle est chargée dans le GC, puis nous sommes prêts à fonctionner.
- Analysez les données. Familiarisez-vous avec le chromatogramme en phase gazeuse et comment accéder au spectre de masse sous chaque pic de chromatogramme et utilisez la base de données pour identifier le composé.
Détails
4. Créer une méthode dans le GC
1. Quel est le point d'ébullition des composés qui vous intéressent ? Quel est le point d'ébullition le plus élevé des composés de votre échantillon ? Quelle est la température la plus élevée à laquelle vous pouvez faire fonctionner votre colonne ? Par exemple, une colonne HP 5 non polaire correspond à des types de colonne de 325 °C (je ne ferais pas fonctionner au-dessus de 300 °C régulièrement), mais une colonne polaire ne fait que 250 °C. Si vous exécutez au-dessus de ces températures, la colonne commencera à se détériorer, ce qui signifie que le matériau de la colonne sera porté à la spécification de masse et apparaîtra (ou les deux) comme une ligne de base élevée avec des pics de spécification de masse compatibles avec le matériau de la colonne ou il y aura être des pics de chromatogramme qui montrent la spécification de masse du matériau de la colonne. Sachez à quoi ressemble la spécification de masse du saignement de colonne afin de pouvoir l'identifier. Saignement de la colonne et du septum La colonne se trouve à l'intérieur du four GC et ressemble à ceci :
L'entrée est vue en haut à gauche et la colonne émerge de là, elle fait 30 m et s'enroule juste devant le ventilateur du réchauffeur, elle entre dans le spectromètre de masse sur la paroi gauche. Il fait souvent chaud, soyez prudent. Réglez la température du four de manière à ce que tout le matériau soit transporté à travers la colonne pendant le cycle, même les composés qui ne vous intéressent pas. Si vous ne le faites pas, le matériau restera sur la colonne et contaminera votre prochain cycle. Exécuter un blanc est une bonne pratique pour s'assurer que tout est propre. Les réglages de la température du four sont accessibles dans le logiciel sous l'icône du four qui ressemble à une colonne.
Lorsque vous cliquez sur l'icône du four, une autre page s'ouvre dans laquelle vous pouvez régler la rampe de température du four.
La plupart des paramètres du GC sont accessibles à partir d'ici. De gauche à droite, les icônes signifient : Le premier est l'ALS, qui choisit la méthode d'injection, qui peut être manuelle ou passeur d'échantillons. Il n'y a pas de vannes sur nos instruments mais il pourrait y avoir des vannes de gaz. Vient ensuite l'entrée, nous nous en occuperons ensuite. Les réchauffeurs AUX peuvent être d'autres composants qui ont besoin de chaleur, il peut s'agir d'une vanne de gaz ou de la ligne allant du GC au MS. 2. L'entrée doit être à une températuret vaporizes all the compounds, what is that?
The inlet settings in the program that operates and runs the GC:MS can be located by clicking with the mouse on the oven icon in the software, followed by the inlet icon. inlet
La température de l'inlet dans cette méthode est fixée à 200°C, les échantillons que cette méthode est destinée à analyser sont des composés organiques peu volatils, contrairement aux terpènes des huiles essentielles et des hydrolats. La température dans l'inlet doit vaporiser toute votre composés sans les décomposer.
3. La répartition de l'admission est définie ici. L'échantillon n'est pas entièrement envoyé à la colonne, une partie est envoyée aux déchets et une partie seulement à la colonne.
Quel ratio de partage dois-je utiliser ?
4. Une grande fraction est choisie pour les échantillons concentrés, GC:MS est une analyse sensible et les concentrations dépassant 1 mg/ml doivent être diluées. 4. La pression du gaz porteur d'hélium est également visible ici, c'est une bonne pression pour la séparation. L'hélium gazeux peut fonctionner à débit constant ou à pression constante, il y a des avantages et des inconvénients pour chacun. Ceci est défini dans l'icône de la colonne. Connaître ou faire une estimation éclairée des points d'ébullition de vos composés aidera à décider de toutes ces quantités, mais des essais et des erreurs sont souvent nécessaires pour concevoir la meilleure méthode. La pression à laquelle la colonne est soumise affectera les points d'ébullition de vos composés. À quelle pression/débit et gradient de température dois-je faire fonctionner le gaz vecteur d'hélium ? Encore une fois, 10psi et 12°C par minute sont de bons points de départ. La plupart des gens utilisent une méthode à débit constant qui déterminera la pression d'hélium. 1-2 ml/min est une bonne suggestion. Vous pouvez modifier cela pour obtenir la meilleure séparation des pics du chromatogramme et l'exécution plus rapide, l'équilibre. Les débits sont contrôlés dans les paramètres de la colonne. Remarque : Pour les colonnes non polaires, le point d'ébullition est le critère le plus important pour l'ordre d'émergence de la colonne, mais pour une colonne plus polaire, l'interaction de la colonne avec la structure moléculaire jouera un rôle très important dans l'ordre des pics.
- Créer une méthode dans le GC, exemple : 0,2 µL d'huile essentielle ont été injectés dans l'entrée d'un chromatographe en phase gazeuse Agilent 7820A. L'entrée a été chauffée à 150°C pour volatiliser l'huile avant d'être transportée vers la colonne par l'hélium gazeux. Le gaz porteur était à une pression de 10,1 psi et un débit de 16,5 ml/min. Le rapport de division d'entrée a été fixé à 10:1, ce qui signifie qu'environ 9 % de l'échantillon volatilisé est entré dans la colonne et le reste a été envoyé aux déchets. Ceci est fait pour éviter de surcharger la colonne ainsi que de saturer le détecteur de l'instrument MS. Une colonne de chromatographie HP5-MS non polaire de 30 m de long avec un diamètre de 250 µm et une taille de pores de 0,25 µm d'Agilent (Mississauga, Ontario, Canada) a été utilisée pour séparer les composés. La phase stationnaire de la colonne est composée à 95% de siloxane méthylé avec 5% de phénylsiloxane permettant une meilleure séparation des analytes non polaires tels que les terpénoïdes présents dans les huiles essentielles. La température du four a été maintenue à 40°C pendant une minute puis augmentée à 300°C pendant les treize minutes suivantes à une vitesse de 20°C/min puis maintenue constante à 300°C pendant 2 minutes. Cette basse température de départ a été utilisée car les huiles essentielles sont très volatiles et la plupart des composés éluent à basse température. Les échantillons éluent principalement dans l'ordre de leurs volatilités relatives mais les interactions de Van Der Waals entre les composés et la phase stationnaire non polaire améliorent la séparation.
- Créer une méthode dans le MS Ceci n'est souvent pas altéré, mais il contient le minutage de sorte que le front de solvant n'est pas visible.
Ceci est accessible via l'icône qui ressemble à un quadripôle à côté de l'icône de la colonne. Le solvant retarde dans la première case. Rien d'autre n'a tendance à être modifié ici. Les tensions sur le quadripôle sont optimisées lors d'un accord et le MS dispose d'une solution d'accord PFTBA située à proximité de la source qu'il utilise. Perfluorotributylamine - Wikipédia La source est une source d'impact d'électrons qui est réglée sur le 70eV standardisé que tout le monde utilise. Le filtre de masse est un simple quadruple. Quadruple
Les paramètres GC et MS sont également accessibles dans le logiciel à l'aide des onglets, voir ci-dessous.
- Analysez les données. Les données sont visualisées et manipulées dans un programme différent de celui qui fait fonctionner l'instrument. Le programme s'appelle "Enhanced Data Analysis".
Vous chargez l'échantillon exécuté à l'aide de l'onglet Fichier. Vous aurez besoin des temps de rétention sur chacun des pics du chromatogramme, vus dans la fenêtre du haut et numériquement dans la fenêtre du bas. La fenêtre inférieure s'appelle le "rapport de pourcentage" et affiche les temps et la surface de rétention sous chaque pic et le pourcentage de chaque pic par rapport à tous les pics. Ceci est obtenu en cliquant sur l'onglet chromatogramme et en sélectionnant RAPPORT DE POURCENTAGE. Pour acquérir le spectre de masse et identifier chaque composé représenté par chaque pic, il est nécessaire de zoomer sur les pics individuels et d'échantillonner la zone à l'intérieur d'un pic à l'aide de la souris.
Lorsque vous faites cela, la fenêtre du bas affiche le spectre de masse pour ce pic. Si vous double-cliquez sur le spectre de masse, il recherchera dans la base de données un spectre correspondant. Quand il en trouvera quelques-uns, il produira une fenêtre vous montrant ses choix.
La boîte vous indique quelle base de données elle a utilisée et quels composés elle correspondait également à votre spectre de masse. Il vous indique à quel point ils correspondent à 100% étant parfaits et il vous montre également les spectres de la base de données. Cela peut aussi se faire automatiquement sous l'onglet spectres, choisissez Library Search Report, il y a deux options résumé et détaillé. Le logiciel recherchera automatiquement chaque pic et fera correspondre le spectre de masse et produira un PDF qui peut être enregistré ou imprimé. La compétence consiste à évaluer les choix de logiciels.
Chromatogram.
Percentage Report
Le pic du spectre de masse du chromatogramme à 8,629 minutes correspond à 98 % par la base de données au citronellal. Cette huile essentielle est la citronnelle, nous pouvons donc être sûrs que c'est bien de cela qu'il s'agit.
